Już w 2015r pracowano nad stworzeniem nowego koronawirusa. Dowodem na to może być publikacja naukowa w znanym brytyjskim czasopiśmie “Nature Medicine” pod tytułem "Gromada krążących koronawirusów nietoperzy przypominająca SARS wykazuje potencjał do pojawienia się u ludzi". Powinniśmy zadać sobie pytanie, czy była to realizacja większego planu, wirus "tylko wymknął się spod kontroli"?
 |
| Obraz Gerd Altmann z Pixabay |
Poniżej tłumaczenie artykułu.
Wstęp
Pojawienie się koronawirusa ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV) i bliskowschodniego zespołu oddechowego (MERS) -CoV podkreśla zagrożenie transmisją międzygatunkową prowadzącą do wybuchów epidemii u ludzi. W tym miejscu badamy potencjał chorobowy wirusa podobnego do SARS, SHC014-CoV, który obecnie krąży w populacjach podkowca chińskiego1. Korzystając z systemu odwrotnej genetyki SARS-CoV2, wygenerowaliśmy i scharakteryzowaliśmy chimerycznego wirusa wykazującego ekspresję kolca koronawirusa nietoperzy SHC014 w zaadaptowanym przez mysz szkielecie SARS-CoV. Wyniki wskazują, że wirusy z grupy 2b kodujące skok SHC014 w kręgosłupie typu dzikiego mogą skutecznie wykorzystywać wiele ortologów receptora SARS ludzkiego enzymu konwertującego angiotensynę II (ACE2), skutecznie replikować się w pierwotnych ludzkich komórkach dróg oddechowych i osiągać miana in vitro odpowiadające szczepy SARS-CoV.
Dodatkowo eksperymenty in vivo pokazują replikację chimerycznego wirusa w płucu myszy z widoczną patogenezą. Ocena dostępnych metod immunoterapeutycznych i profilaktycznych opartych na SARS wykazała słabą skuteczność; zarówno przeciwciała monoklonalne, jak i szczepionki nie zdołały zneutralizować i ochronić przed zakażeniem CoV przy użyciu nowego białka wypustek. Na podstawie tych ustaleń syntetycznie wyprowadziliśmy zakaźnego rekombinowanego wirusa SHC014 o pełnej długości i wykazaliśmy silną replikację wirusa zarówno in vitro, jak i in vivo. Nasza praca sugeruje potencjalne ryzyko ponownego pojawienia się SARS-CoV przez wirusy obecnie krążące w populacjach nietoperzy.
Część główna.
Pojawienie się SARS-CoV zapoczątkowało nową erę przenoszenia międzygatunkowego poważnych chorób układu oddechowego, a globalizacja doprowadziła do szybkiego rozprzestrzeniania się na całym świecie i ogromnego wpływu gospodarczego3,4. Od tego czasu kilka szczepów - w tym szczepy grypy A H5N1, H1N1 i H7N9 oraz MERS-CoV - wyłoniło się z populacji zwierząt, powodując znaczne choroby, śmiertelność i trudności ekonomiczne w dotkniętych chorobą regionach5.
Chociaż środki zdrowia publicznego były w stanie powstrzymać epidemię SARS-CoV4, ostatnie badania metagenomiczne zidentyfikowały sekwencje blisko spokrewnionych wirusów podobnych do SARS krążących w populacjach chińskich nietoperzy, które mogą stanowić przyszłe zagrożenie1,6. Jednak same dane sekwencyjne zapewniają minimalny wgląd w identyfikację i przygotowanie się na przyszłe prepandemiczne wirusy. Dlatego też, aby zbadać potencjał pojawienia się (czyli możliwość zakażenia ludzi) krążących CoV nietoperzy, zbudowaliśmy chimerycznego wirusa kodującego nowe, odzwierzęce białko szczytowe CoV - z sekwencji RsSHC014-CoV, która została wyizolowana z chińskich podkowców1— w kontekście szkieletu przystosowanego do myszy SARS-CoV. Wirus hybrydowy pozwolił nam ocenić zdolność nowego białka wypustek do wywoływania choroby niezależnie od innych niezbędnych mutacji adaptacyjnych w jego naturalnym szkielecie. Stosując to podejście, scharakteryzowaliśmy infekcję CoV, w której pośredniczy białko SHC014 w pierwotnych ludzkich komórkach dróg oddechowych i in vivo, oraz przetestowaliśmy skuteczność dostępnych immunoterapeutyków przeciwko SHC014-CoV. Strategia ta razem przekłada dane metagenomiczne, aby pomóc przewidywać i przygotować się na przyszłe pojawiające się wirusy.
Sekwencje SHC014 i powiązanego RsWIV1-CoV pokazują, że te CoV są najbliższymi krewnymi epidemicznych szczepów SARS-CoV (ryc. 1a, b); jednakże istnieją istotne różnice w 14 resztach, które wiążą się z ludzkim ACE2, receptorem SARS-CoV, w tym w pięciu, które są krytyczne dla zakresu gospodarzy: Y442, L472, N479, T487 i Y491 (ref. 7). W WIV1 trzy z tych reszt różnią się od epidemicznego szczepu SARS-CoV Urbani, ale nie spodziewano się, że zmienią one wiązanie ACE2 (uzupełniający ryc. 1a, b i uzupełniająca tabela 1). Fakt ten potwierdzają zarówno eksperymenty pseudotypowania, w których mierzono zdolność lentiwirusów kodujących wypustki białek WIV1 do wnikania do komórek wyrażających ludzką ACE2 (rysunek uzupełniający 1), jak i testy replikacji WIV1-CoV in vitro (ref. 1). W przeciwieństwie do tego, 7 z 14 reszt interakcji ACE2 w SHC014 różni się od tych w SARS-CoV, w tym wszystkie pięć reszt krytycznych dla zakresu gospodarza (rysunek uzupełniający 1c i tabela uzupełniająca 1). Te zmiany, w połączeniu z niepowodzeniem pseudotypowanych lentiwirusów eksprymujących impuls SHC014, aby dostać się do komórek (rysunek uzupełniający 1d), sugerowały, że ostrze SHC014 nie jest w stanie wiązać ludzkiego ACE2. Jednak zgłoszono podobne zmiany w pokrewnych szczepach SARS-CoV, które umożliwiły wiązanie ACE27,8, co sugeruje, że do weryfikacji wymagane były dodatkowe testy funkcjonalne. Dlatego zsyntetyzowaliśmy ostrze SHC014 w kontekście zdolnego do replikacji, przystosowanego do myszy szkieletu SARS-CoV (dalej określamy chimeryczny CoV jako SHC014-MA15), aby zmaksymalizować możliwości patogenezy i badań szczepionek u myszy (ryc. . 2a). Pomimo przewidywań z modelowania opartego na strukturze i eksperymentów z pseudotypowaniem, SHC014-MA15 był żywotny i replikowany do wysokich mian w komórkach Vero (uzupełniający ryc. 2b). Podobnie jak SARS, SHC014-MA15 również wymagał funkcjonalnej cząsteczki ACE2 do wejścia i mógł wykorzystywać ortologi ACE2 człowieka, cyweta i nietoperza (rysunek uzupełniający 2c, d). Aby przetestować zdolność ostrza SHC014 do pośredniczenia w zakażeniu ludzkich dróg oddechowych, zbadaliśmy wrażliwość linii ludzkich komórek nabłonka dróg oddechowych Calu-3 2B4 (ref. 9) na zakażenie i stwierdziliśmy silną replikację SHC014-MA15, porównywalną z SARS-CoV Urbani (ryc. 1c). Aby rozszerzyć te wyniki, pierwotne hodowle ludzkiego nabłonka dróg oddechowych (HAE) zostały zakażone i wykazały silną replikację obu wirusów (ryc. 1d). Razem dane potwierdzają zdolność wirusów z ostrzem SHC014 do infekowania ludzkich komórek dróg oddechowych i podkreślają potencjalne zagrożenie przenoszeniem SHC014-CoV międzygatunkowego.
Aby ocenić rolę ostrza SHC014 w pośredniczeniu w zakażeniu in vivo, 10-tygodniowe myszy BALB / c zainfekowaliśmy 104 jednostkami tworzącymi łysinki (pfu) SARS-MA15 lub SHC014-MA15 (ryc. 1e-h) . Zwierzęta zakażone SARS-MA15 doświadczyły szybkiej utraty wagi i śmiertelności do 4 dni po zakażeniu (d.p.i.); przeciwnie, infekcja SHC014-MA15 spowodowała znaczną utratę wagi (10%), ale nie śmiertelność u myszy (Ryc. 1e). Badanie replikacji wirusa ujawniło prawie równoważne miana wirusa w płucach myszy zakażonych SARS-MA15 lub SHC014-MA15 (ryc. 1f). Podczas gdy płuca myszy zakażonych SARS-MA15 wykazywały silne zabarwienie zarówno w końcowych oskrzelikach, jak i w miąższu płuc 2 d.p.i. (Ryc. 1g), myszy zakażone SHC014-MA15 wykazywały zmniejszone barwienie antygenem w drogach oddechowych (Fig. 1h); w przeciwieństwie do tego, nie obserwowano deficytu w barwieniu antygenu w miąższu ani w ogólnej ocenie histologicznej, co sugeruje zakażenie różnicowe tkanki płucnej dla SHC014-MA15 (tabela uzupełniająca 2). Następnie przeanalizowaliśmy infekcję u bardziej podatnych, starszych (12-miesięcznych) zwierząt. Zwierzęta zakażone SARS-MA15 szybko traciły na wadze i ulegały infekcji (uzupełniający ryc. 3a, b). Infekcja SHC014-MA15 indukowała silną i trwałą utratę wagi, ale miała minimalną śmiertelność. Trendy w histologii i wzorach barwienia antygenem, które obserwowaliśmy u młodych myszy, były zachowane u starszych zwierząt (tabela uzupełniająca 3). Wykluczyliśmy możliwość, że SHC014-MA15 pośredniczyła w zakażeniu przez alternatywny receptor na podstawie eksperymentów z użyciem myszy Ace2 - / -, które nie wykazały utraty masy ciała ani barwienia antygenem po zakażeniu SHC014-MA15 (ryc. Uzupełniający 4a, b i uzupełniający Tabela 2). Razem dane wskazują, że wirusy z kolcem SHC014 są zdolne do wywoływania utraty wagi u myszy w kontekście zjadliwego szkieletu CoV.
Biorąc pod uwagę przedkliniczną skuteczność terapii przeciwciałami monoklonalnymi przeciw Ebola, takimi jak ZMApp10, następnie staraliśmy się określić skuteczność przeciwciał monoklonalnych SARS-CoV przeciwko infekcji SHC014-MA15. Wcześniej opisano cztery szeroko neutralizujące ludzkie przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko białku wypustek SARS-CoV i są one prawdopodobnymi odczynnikami do immunoterapii11,12,13. Zbadaliśmy wpływ tych przeciwciał na replikację wirusa (wyrażony jako procent hamowania replikacji wirusa) i stwierdziliśmy, że podczas gdy SARS-CoV Urbani typu dzikiego był silnie neutralizowany przez wszystkie cztery przeciwciała przy stosunkowo niskich stężeniach przeciwciał (ryc. 2a – d), neutralizacja była różna dla SHC014-MA15. Fm6, przeciwciało wytworzone przez prezentację fagową i mutanty ucieczki 11,12, osiągnęło jedynie podstawowe poziomy hamowania replikacji SHC014-MA15 (Fig. 2a). Podobnie przeciwciała 230.15 i 227.14, które pochodziły z komórek pamięci B pacjentów zakażonych SARS-CoV13, również nie blokowały replikacji SHC014-MA15 (ryc. 2b, c). W przypadku wszystkich trzech przeciwciał różnice między sekwencjami aminokwasów SARS i SHC014 odpowiadały bezpośrednim lub sąsiednim zmianom reszt stwierdzonym w mutantach wymykających się z SARS-CoV (fm6 N479R; 230,15 L443V; 227,14 K390Q / E), co prawdopodobnie wyjaśnia brak przeciwciał „działanie neutralizujące przeciwko SHC014. Ostatecznie przeciwciało monoklonalne 109.8 było w stanie osiągnąć 50% neutralizację SHC014-MA15, ale tylko przy wysokich stężeniach (10 μg / ml) (ryc. 2d). Razem wyniki pokazują, że przeciwciała neutralizujące w szerokim zakresie przeciwko SARS-CoV mogą mieć jedynie marginalną skuteczność przeciwko pojawiającym się szczepom CoV podobnym do SARS, takim jak SHC014.
Aby ocenić skuteczność istniejących szczepionek przeciwko infekcji SHC014-MA15, zaszczepiliśmy starsze myszy podwójnie inaktywowanym całym SARS-CoV (DIV). Wcześniejsze prace wykazały, że DIV może neutralizować i chronić młode myszy przed prowokacją wirusem homologicznym14; jednakże szczepionka nie chroniła starszych zwierząt, u których obserwowano również zwiększoną patologię immunologiczną, co wskazuje na możliwość krzywdzenia zwierząt w wyniku szczepienia15. Tutaj stwierdziliśmy, że DIV nie zapewnia ochrony przed prowokacją SHC014-MA15 w odniesieniu do utraty wagi lub miana wirusa (uzupełniający ryc. 5a, b). Zgodnie z poprzednim raportem z innymi heterologicznymi grupami 2b CoV15, surowica od starszych myszy szczepionych DIV również nie była w stanie zneutralizować SHC014-MA15 (uzupełniający ryc. 5c). Warto zauważyć, że szczepienie DIV spowodowało silną patologię immunologiczną (tabela uzupełniająca 4) i eozynofilię (ryc. Uzupełniający 5d – f). Wszystkie te wyniki potwierdzają, że szczepionka DIV nie chroniłaby przed zakażeniem SHC014 i mogłaby prawdopodobnie nasilać chorobę w grupie szczepionej w podeszłym wieku.
W przeciwieństwie do szczepienia myszy DIV, zastosowanie SHC014-MA15 jako żywej, atenuowanej szczepionki wykazało potencjalną ochronę krzyżową przed prowokacją SARS-CoV, ale wyniki mają ważne zastrzeżenia. Zainfekowaliśmy młode myszy 104 p.f.u. SHC014-MA15 i obserwował je przez 28 dni. Następnie prowokowaliśmy myszy SARS-MA15 w dniu 29 (uzupełniający ryc. 6a). Wcześniejsze zakażenie myszy wysoką dawką SHC014-MA15 zapewniło ochronę przed prowokacją śmiertelną dawką SARS-MA15, chociaż wystąpiła tylko minimalna odpowiedź neutralizacji SARS-CoV z surowicy odpornościowej wywołanej 28 dni po zakażeniu SHC014-MA15 ( Rys. Uzupełniający 6b, 1: 200). W przypadku braku wtórnej dawki przypominającej antygen 28 d.p.i. przedstawia oczekiwany szczyt mian przeciwciał i sugeruje, że ochrona przed SARS-CoV będzie zmniejszona w czasie16,17. Podobne wyniki pokazujące ochronę przed prowokacją śmiertelną dawką SARS-CoV obserwowano u starszych myszy BALB / c w odniesieniu do utraty wagi i replikacji wirusa (uzupełniający ryc. 6c, d). Jednak dawka infekcji SHC014-MA15 wynosząca 104 p.f.u. spowodował> 10% utratę masy ciała i śmiertelność u niektórych starszych zwierząt (ryc. 1 i uzupełniający ryc. 3). Stwierdziliśmy, że szczepienie niższą dawką SHC014-MA15 (100 p.f.u.) nie spowodowało utraty wagi, ale również nie ochroniło starzejących się zwierząt przed śmiertelną dawką SARS-MA15 (rysunek uzupełniający 6e, f). Razem dane sugerują, że prowokacja SHC014-MA15 może nadać ochronę krzyżową przeciwko SARS-CoV poprzez konserwatywne epitopy, ale wymagana dawka indukuje patogenezę i wyklucza użycie jako szczepionki atenuowanej.
Po ustaleniu, że ostrze SHC014 ma zdolność pośredniczenia w zakażaniu ludzkich komórek i wywoływania choroby u myszy, następnie zsyntetyzowaliśmy klon zakaźny SHC014-CoV pełnej długości w oparciu o podejście zastosowane dla SARS-CoV (ryc. 3a) 2. Replikacja w komórkach Vero nie ujawniła deficytu SHC014-CoV w porównaniu z SARS-CoV (Fig. 3b); jednakże SHC014-CoV był znacząco (P <0,01) atenuowany w pierwotnych hodowlach HAE zarówno po 24, jak i 48 godzinach po zakażeniu (ryc. 3c). Infekcja myszy in vivo nie wykazała znaczącej utraty wagi, ale wykazała zmniejszoną replikację wirusa w płucach pełnej długości infekcji SHC014-CoV w porównaniu z SARS-CoV Urbani (ryc. 3d, e). Razem wyniki określają żywotność SHC014-CoV pełnej długości, ale sugerują, że konieczna jest dalsza adaptacja, aby jego replikacja była równoważna replikacji epidemicznego SARS-CoV w ludzkich komórkach oddechowych i myszach.
Podczas epidemii SARS-CoV szybko ustalono powiązania między cybetami palmowymi a szczepami CoV wykrytymi u ludzi4. Opierając się na tym odkryciu, powszechny paradygmat pojawiania się dowodzi, że epidemia SARS-CoV powstała jako wirus nietoperza, przeskoczyła do cywetów i wprowadziła zmiany w domenie wiążącej receptor (RBD), aby poprawić wiązanie z cywetem Ace2 (ref. 18). Późniejsza ekspozycja ludzi na targowiskach żywych zwierząt pozwoliła na zakażenie człowieka szczepem cyweta, który z kolei przystosował się do szczepu epidemicznego (ryc. 4a). Jednak analiza filogenetyczna sugeruje, że wczesne ludzkie szczepy SARS wydają się być bliżej spokrewnione ze szczepami nietoperzy niż ze szczepami cywetów18. Dlatego drugi paradygmat wskazuje, że bezpośrednie przeniesienie nietoperza na człowieka zapoczątkowało pojawienie się SARS-CoV i że cywety palmowe służyły jako drugorzędny żywiciel i rezerwuar dla ciągłej infekcji (ryc. 4b) 19. W przypadku obu paradygmatów adaptacja kolca u gospodarza wtórnego jest postrzegana jako konieczność, przy czym oczekuje się, że większość mutacji wystąpi w obrębie RBD, co ułatwia poprawę infekcji. Obie teorie sugerują, że pule CoV nietoperzy są ograniczone, a mutacje w zasięgu żywicieli są zarówno przypadkowe, jak i rzadkie, co zmniejsza prawdopodobieństwo przyszłych zdarzeń pojawienia się u ludzi.
Chociaż nasze badanie nie unieważnia innych dróg pojawiania się, argumentuje za trzecim paradygmatem, w którym krążące pule CoV nietoperzy utrzymują „gotowe” białka kolców, które są zdolne do zakażania ludzi bez mutacji lub adaptacji (ryc. 4c). Tę hipotezę ilustruje zdolność chimerycznego wirusa zawierającego ostrze SHC014 w szkielecie SARS-CoV do wywoływania silnej infekcji zarówno w hodowlach ludzkich dróg oddechowych, jak iu myszy bez adaptacji RBD. W połączeniu z obserwacją wcześniej zidentyfikowanych patogennych szkieletów CoV3,20, nasze wyniki sugerują, że materiały wyjściowe wymagane dla wyłaniających się szczepów podobnych do SARS krążą obecnie w rezerwuarach zwierząt. Warto zauważyć, że chociaż pełnej długości SHC014-CoV prawdopodobnie wymaga dodatkowej adaptacji kręgosłupa w celu pośredniczenia w chorobach ludzi, udokumentowane zdarzenia rekombinacyjne o wysokiej częstotliwości w rodzinach CoV podkreślają możliwość przyszłego pojawienia się i potrzebę dalszych przygotowań.
Do tej pory badania genomiczne populacji zwierząt były wykorzystywane przede wszystkim do identyfikacji nowych wirusów w warunkach epidemii21. Podejście tutaj rozszerza te zbiory danych o zbadanie kwestii pojawiania się wirusów i skuteczności terapeutycznej. Uważamy, że wirusy z SHC014 stanowią potencjalne zagrożenie ze względu na ich zdolność do replikacji w pierwotnych hodowlach ludzkich dróg oddechowych, najlepszym dostępnym modelu chorób człowieka. Ponadto obserwowana patogeneza u myszy wskazuje na zdolność wirusów zawierających SHC014 do wywoływania choroby w modelach ssaków, bez adaptacji RBD. Warto zauważyć, że zróżnicowany tropizm w płucach w porównaniu z SARS-MA15 i osłabienie pełnej długości SHC014-CoV w hodowlach HAE w porównaniu z SARS-CoV Urbani sugeruje, że czynniki wykraczające poza wiązanie ACE2 - w tym procesywność kolców, biodostępność receptora lub antagonizm odpowiedzi immunologicznej gospodarza - może przyczyniać się do powstania. Konieczne są jednak dalsze badania na naczelnych innych niż ludzie, aby przełożyć te odkrycia na potencjał patogeniczny u ludzi. Co ważne, niepowodzenie dostępnych terapii definiuje krytyczną potrzebę dalszych badań i rozwoju terapii. Dzięki tej wiedzy można opracować programy nadzoru, odczynniki diagnostyczne i skuteczne terapie, które chronią przed pojawieniem się CoV specyficznych dla grupy 2b, takich jak SHC014, i można je zastosować do innych gałęzi CoV, które utrzymują podobnie heterogeniczne pule.
Oprócz oferowania przygotowania przeciwko pojawiającym się w przyszłości wirusom, podejście to należy rozważyć w kontekście zleconych przez rząd Stanów Zjednoczonych badań nad zyskiem funkcji (GOF )22. Na podstawie poprzednich modeli pojawiania się (ryc. 4a, b) nie spodziewano się, że tworzenie chimerycznych wirusów, takich jak SHC014-MA15, zwiększy patogeniczność. Chociaż SHC014-MA15 jest atenuowana w porównaniu z SARS-CoV przystosowanym do myszy rodzicielskich, podobne badania oceniające patogenność CoV z dzikim kolcem Urbani w szkielecie MA15 nie wykazały utraty masy ciała u myszy i zmniejszonej replikacji wirusa23. Zatem w porównaniu z ostrzem Urbani-MA15 CoV, SHC014-MA15 wykazuje wzrost patogenezy (ryc. 1). Na podstawie tych ustaleń panele przeglądu naukowego mogą uznać, że podobne badania nad budową wirusów chimerycznych opartych na krążących szczepach są zbyt ryzykowne, ponieważ nie można wykluczyć zwiększonej patogenności w modelach ssaków. W połączeniu z ograniczeniami dotyczącymi szczepów przystosowanych do myszy i rozwojem przeciwciał monoklonalnych przy użyciu mutantów wymykających się, badania nad pojawieniem się CoV i skutecznością terapeutyczną mogą być poważnie ograniczone. Razem te dane i ograniczenia stanowią skrzyżowanie zainteresowań badawczych GOF; potencjał przygotowania się do przyszłych wybuchów epidemii i ich złagodzenia należy rozważyć w kontekście ryzyka tworzenia bardziej niebezpiecznych patogenów. Przy opracowywaniu polityk idących naprzód ważne jest, aby wziąć pod uwagę wartość danych wygenerowanych w tych badaniach i czy tego typu badania nad wirusami chimerycznymi uzasadniają dalsze badania w porównaniu z nieodłącznym ryzykiem.
Ogólnie rzecz biorąc, w naszym podejściu wykorzystano dane metagenomiczne do zidentyfikowania potencjalnego zagrożenia stwarzanego przez krążącego nietoperza, podobnego do SARS, CoV SHC014. Ze względu na zdolność chimerycznych wirusów SHC014 do replikacji w hodowlach ludzkich dróg oddechowych, wywoływania patogenezy in vivo i unikania obecnych leków, istnieje potrzeba zarówno nadzoru, jak i ulepszonych terapii przeciwko krążącym wirusom podobnym do SARS. Nasze podejście umożliwia również wykorzystanie danych metagenomicznych do przewidywania pojawienia się wirusów i zastosowania tej wiedzy w przygotowaniach do leczenia pojawiających się w przyszłości infekcji wirusowych.
Wirusy, komórki, zakażenia in vitro i testy łysinek.
Dzikie SARS-CoV (Urbani), SARS-CoV przystosowane do myszy (MA15) i chimeryczne CoV podobne do SARS hodowano na komórkach Vero E6 (uzyskanych z United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases), hodowanych w zmodyfikowanym przez Dulbecco's Eagle's pożywka (DMEM) (Gibco, CA) i 5% płodowa surowica klonów (FCS) (Hyclone, South Logan, UT) wraz z antybiotykiem / lekiem przeciwgrzybiczym (Gibco, Carlsbad, CA). Komórki DBT (laboratorium Baric, źródło nieznane) wykazujące ekspresję ortologów ACE2 zostały wcześniej opisane zarówno dla ludzi, jak i dla cywetów; Sekwencję bat Ace2 oparto na sekwencji z Rhinolophus leschenaulti, a komórki DBT eksprymujące bat Ace2 ustalono, jak opisano wcześniej8. Eksperymenty z pseudotypowaniem były podobne do tych wykorzystujących pseudowirusy oparte na HIV, przygotowane jak opisano wcześniej10 i badane na komórkach HeLa (Wuhan Institute of Virology), które wyrażały ortologi ACE2. Komórki HeLa hodowano w minimalnej pożywce niezbędnej (MEM) (Gibco, CA) uzupełnionej 10% FCS (Gibco, CA), jak opisano wcześniej24. Krzywe wzrostu w komórkach Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 i pierwotnych ludzkich komórkach nabłonka dróg oddechowych wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem8,25. Żadna z pracujących linii komórkowych nie została ostatnio potwierdzona autentycznością ani testowana na obecność mykoplazmy, chociaż oryginalne zapasy nasion użyte do stworzenia zapasów roboczych są wolne od zanieczyszczeń. Ludzkie płuca do hodowli HAE zostały pozyskane w ramach protokołów zatwierdzonych przez University of North Carolina w Chapel Hill Institutional Review Board. Hodowle HAE reprezentują wysoce zróżnicowany ludzki nabłonek dróg oddechowych, zawierający komórki nabłonka rzęskowego i niewrzęsionego, a także komórki kubkowe. Kultury hoduje się również na granicy faz powietrze-ciecz przez kilka tygodni przed użyciem, jak opisano wcześniej26. W skrócie, komórki przemyto PBS i zaszczepiono wirusem lub próbnie rozcieńczono w PBS przez 40 minut w 37 ° C. Po zaszczepieniu komórki przemyto trzy razy i dodano świeżą pożywkę, aby oznaczyć czas „0”. W każdym opisanym punkcie czasowym zbierano trzy lub więcej powtórzeń biologicznych. Nie zastosowano zaślepienia w żadnej próbce pobranej, ani też próbek nie poddano randomizacji. Cała hodowla wirusów została przeprowadzona w laboratorium na poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 3 z nadmiarowymi wentylatorami w szafach bezpieczeństwa biologicznego, jak opisano wcześniej przez naszą grupę2. Cały personel nosił zasilane respiratory oczyszczające powietrze (Breathe Easy, 3M) wraz z kombinezonami, fartuchami i butami Tyvek oraz podwójnymi rękawiczkami.
Grupowanie sekwencji i modelowanie strukturalne.
Sekwencje genomowe pełnej długości i sekwencje aminokwasowe domen S1 spike'a reprezentatywnych CoV zostały pobrane z Genbank lub Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC), dopasowane do ClustalX i porównane filogenetycznie przy użyciu oszacowania maksymalnego prawdopodobieństwa przy użyciu 100 bootstrapów lub przez używając odpowiednio pakietu PhyML (https://code.google.com/p/phyml/). Drzewo zostało wygenerowane z maksymalnym prawdopodobieństwem za pomocą pakietu PhyML. Słupek skali przedstawia podstawienia nukleotydów. Etykietowane są tylko węzły z obsługą ładowania początkowego powyżej 70%. Drzewo pokazuje, że CoV są podzielone na trzy odrębne grupy filogenetyczne zdefiniowane jako α-CoV, β-CoV i γ-CoV. Klasyczne podgrupy są oznaczone jako 2a, 2b, 2c i 2d dla β-CoV oraz 1a i 1b dla α-CoV. Modele strukturalne zostały wygenerowane przy użyciu Modeller (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) w celu wygenerowania modeli homologii dla SHC014 i Rs3367 SARS RBD w kompleksie z ACE2 w oparciu o strukturę krystaliczną 2AJF (Protein Data Bank). Modele homologii zostały zwizualizowane i zmanipulowane w MacPyMol (wersja 1.3).
Budowa chimerycznych wirusów podobnych do SARS.
Zarówno wirusy typu dzikiego, jak i chimeryczne pochodziły z SARS-CoV Urbani lub odpowiedniego klonu zakaźnego (SARS-CoV MA15) przystosowanego do myszy (SARS-CoV MA15), jak opisano wcześniej27. Plazmidy zawierające sekwencje wypustek dla SHC014 ekstrahowano przez trawienie restrykcyjne i wligowano do plazmidów E i F zakaźnego klonu MA15. Klon zaprojektowano i zakupiono od Bio Basic jako sześć ciągłych cDNA przy użyciu opublikowanych sekwencji oflankowanych przez unikalne miejsca restrykcyjne endonukleazy klasy II (BglI). Następnie plazmidy zawierające chimeryczne fragmenty genomu SARS-CoV i SHC014-CoV typu dzikiego amplifikowano, wycinano, ligowano i oczyszczano. Następnie przeprowadzono reakcje transkrypcji in vitro w celu zsyntetyzowania pełnej długości genomowego RNA, który transfekowano do komórek Vero E6, jak opisano wcześniej2. Pożywkę z transfekowanych komórek zbierano i podawano jako zapasy nasienne do kolejnych eksperymentów. Wirusy chimeryczne i wirusy pełnej długości zostały potwierdzone przez analizę sekwencji przed zastosowaniem w tych badaniach. Syntetyczna konstrukcja chimerycznego mutanta i pełnej długości SHC014-CoV została zatwierdzona przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Północnej Karoliny i komitet ds. Badań obaw dotyczących podwójnego zastosowania.
Oświadczenie dotyczące etyki.
Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Urzędu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt przez Urząd ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych (OLAW) PZH. Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Północnej Karoliny w Chapel Hill (UNC, numer pozwolenia A-3410-01) zatwierdził protokół badań na zwierzętach (IACUC # 13-033) użyty w tych badaniach.
Myszy i infekcja in vivo.
Samice, 10-tygodniowe i 12-miesięczne myszy BALB / cAnNHsD zamówiono w Harlan Laboratories. Infekcje myszy przeprowadzano zgodnie z wcześniejszym opisem20. W skrócie, zwierzęta przeniesiono do laboratorium BSL3 i pozostawiono na 1 tydzień do aklimatyzacji przed infekcją. W przypadku zakażenia i szczepienia żywym atenuowanym wirusem myszy znieczulono mieszaniną ketaminy i ksylazyny i zakażono donosowo, po prowokacji, 50 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub rozcieńczonym wirusem trzema lub czterema myszami na punkt czasowy. grupę infekcji na dawkę, jak opisano w legendach do rycin. W przypadku pojedynczych myszy zapisy dotyczące infekcji, w tym nie wdychanie całej dawki, bąbelkowanie inokulum z nosa lub infekcja przez usta, mogły prowadzić do wykluczenia danych dotyczących myszy według uznania badacza; po zakażeniu, nie określono innych wcześniej ustalonych kryteriów wykluczenia lub włączenia. W żadnych eksperymentach na zwierzętach nie stosowano zaślepienia, a zwierzęta nie były randomizowane. W celu szczepienia młode i starsze myszy zaszczepiono przez wstrzyknięcie do łapy 20 μl objętości 0,2 μg podwójnie inaktywowanej szczepionki SARS-CoV z ałunem lub pozorowanym PBS; 22 dni później myszy otrzymywały dawkę przypominającą tym samym schematem, a 21 dni później prowokację. We wszystkich grupach, zgodnie z protokołem, zwierzęta monitorowano codziennie pod kątem klinicznych objawów choroby (garbienie, potargane futro i zmniejszona aktywność) przez czas trwania eksperymentu. Utratę masy ciała monitorowano codziennie przez pierwsze 7 dni, po czym monitorowanie masy ciała kontynuowano, aż zwierzęta odzyskały swoją początkową masę początkową lub wykazywały przyrost masy ciała w sposób ciągły przez 3 dni. Wszystkie myszy, które straciły więcej niż 20% swojej początkowej masy ciała, były karmione mielone i dalej monitorowane wiele razy dziennie, o ile znajdowały się poniżej 20% wartości granicznej. Myszy, które straciły więcej niż 30% swojej początkowej masy ciała, były natychmiast uśmiercane zgodnie z protokołem. Każda mysz uznana za umierającą lub mało prawdopodobną do wyzdrowienia była również uśmiercana w sposób humanitarny według uznania badacza. Eutanazję przeprowadzono z użyciem przedawkowania izofluranu, a zgon potwierdzono zwichnięciem szyjki macicy. Wszystkie badania na myszach przeprowadzono na Uniwersytecie Północnej Karoliny (Animal Welfare Assurance # A3410-01) przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez UNC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
Analiza histologiczna.
Lewe płuco usunięto i zanurzono w 10% buforowanej formalinie (Fisher) bez nadmuchiwania na 1 tydzień. Tkanki zatopiono w parafinie i przygotowano 5-μm skrawki w ośrodku histopatologicznym UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. W celu określenia zakresu barwienia antygenem, skrawki wybarwiano pod kątem antygenu wirusowego przy użyciu dostępnego w handlu poliklonalnego przeciwciała przeciw nukleokapsydowi SARS-CoV (Imgenex) i oceniano w ślepy sposób przez barwienie dróg oddechowych i miąższu, jak opisano wcześniej20. Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopu Olympus BX41 z aparatem Olympus DP71.
Testy neutralizacji wirusa.
Testy miana neutralizacji redukcji łysinek przeprowadzono z uprzednio scharakteryzowanymi przeciwciałami przeciwko SARS-CoV, jak opisano wcześniej11,12,13. W skrócie, neutralizujące przeciwciała lub surowicę seryjnie rozcieńczano dwukrotnie i inkubowano z 100 p.f.u. różnych szczepów zakaźnych klonów SARS-CoV przez 1 godzinę w 37 ° C. Wirus i przeciwciała dodano następnie do 6-dołkowej płytki z 5 x 105 komórek Vero E6 / dołek z wieloma powtórzeniami (n ≥ 2). Po 1 godzinie inkubacji w 37 ° C komórki pokryto 3 ml 0,8% agarozy w pożywce. Płytki inkubowano przez 2 dni w 37 ° C, barwiono obojętną czerwienią przez 3 godziny i liczono łysinki. Procent redukcji łysinek obliczono jako (1 - (liczba łysinek z przeciwciałem / liczba łysinek bez przeciwciała)) x 100.
Analiza statystyczna.
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono dla porównania dwóch grup doświadczalnych (albo dwóch wirusów, albo szczepionych i niezaszczepionych kohort). Dlatego też istotne różnice w mianie wirusa i wynikach histologicznych określono za pomocą dwustronnego testu t-Studenta w poszczególnych punktach czasowych. Dane miały rozkład normalny w każdej porównywanej grupie i miały podobną wariancję.
Bezpieczeństwo biologiczne i bioasekuracja.
Zgłoszone badania rozpoczęto po zatwierdzeniu protokołu eksperymentalnego przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Północnej Karoliny (Tytuł projektu: Generowanie zakaźnych klonów nietoperzy typu SARS-like; Lab Safety Plan ID: 20145741; Schedule G ID: 12279). Badania te zostały zainicjowane przed wstrzymaniem finansowania badań nad procesem deliberatywnym rządu USA w zakresie wybranych badań nad korzyściami z grypy, wirusów MERS i SARS (http://www.phe.gov/s3/dualuse/Documents/gain-of-function .pdf). Ten artykuł został zweryfikowany przez agencję finansującą, NIH. Zażądano kontynuacji tych badań i zostało to zatwierdzone przez PZH.
SARS-CoV jest wybranym agentem. Wszystkie prace związane z tymi badaniami zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP) i warunkami bezpieczeństwa dla SARS-CoV, MERs-CoV i innych powiązanych CoV. Nasze instytucjonalne obiekty CoV BSL3 zostały zaprojektowane tak, aby spełniać wymogi bezpieczeństwa zalecane przez Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), Amerykański Departament Zdrowia i Opieki Społecznej, Publiczną Służbę Zdrowia, Centra Kontroli Chorób (CDC) ) i PZH. Plany bezpieczeństwa laboratoryjnego zostały przedłożone, a obiekt został zatwierdzony do użytku przez Departament Bezpieczeństwa i Higieny Środowiska UNC (EHS) i CDC. Dostęp do obiektu jest możliwy za pomocą karty elektronicznej. Wszyscy pracownicy zostali przeszkoleni przez EHS w zakresie bezpiecznego korzystania z zasilanych respiratorów oczyszczających powietrze (PAPR), a także wdrożono odpowiednie nawyki pracy w placówce BSL3 oraz aktywne plany nadzoru medycznego. Nasze obiekty CoV BSL3 zawierają nadmiarowe wentylatory, zasilanie awaryjne wentylatorów oraz szafy bezpieczeństwa biologicznego i zamrażarki, a nasze obiekty mogą pomieścić stojaki na myszy SealSafe. Materiały sklasyfikowane jako czynniki BSL3 obejmują SARS-CoV, szczepy prekursorowe nietoperza CoV, MERS-CoV i mutanty pochodzące od tych patogenów. W obiektach BSL3 eksperymenty z zakaźnym wirusem są przeprowadzane w certyfikowanej szafie bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC). Wszyscy pracownicy noszą fartuchy, kombinezony i fartuchy Tyvek, PAPR i ochraniacze na buty, a ręce mają w podwójnych rękawiczkach. Użytkownicy BSL3 podlegają planowi nadzoru medycznego monitorowanemu przez Uniwersytecką Klinikę Zdrowia Zawodowego (UEOHC), który obejmuje coroczne fizyczne, coroczne szczepienia przeciw grypie i obowiązkowe zgłaszanie wszelkich objawów związanych z zakażeniem CoV w okresach pracy w BSL3. Wszyscy użytkownicy BSL3 są przeszkoleni w zakresie zarządzania narażeniem i protokołami raportowania, są przygotowani do samodzielnej kwarantanny i zostali przeszkoleni w zakresie bezpiecznej dostawy do lokalnego oddziału zarządzania chorobami zakaźnymi w sytuacji awaryjnej. Wszystkie potencjalne zdarzenia narażenia są zgłaszane i badane przez EHS i UEOHC, a raporty są składane zarówno do CDC, jak i NIH.
Jeśli spodobał Ci się artykuł i masz ochotę docenić moją pracę, możesz "rzucić mi piątaka", klikając przycisk "Postaw kawę" poniżej:
Brak komentarzy:
Prześlij komentarz